MICROPROPAGACIÓN
Resumen
Desde tiempos antiguos, la humanidad se ha dedicado a reproducir aquellas especies vegetales que por sus características productivas y de resistencia innata a plagas y enfermedades les han sido económicamente rentables; pero estos métodos que han utilizado solo les permitía obtener en el tiempo plantas que en la mayoría de los casos se cruzaban perdiendo el vigor hibrido. Hoy en día con las nuevas técnicas de propagación de las especies vegetales como lo es la micropropagación, se ha garantizado la obtención de plantas sanas y puras capaces de aumentar su producción y de tener la resistencia esperada para las plagas y las enfermedades que agobian a dichas plantas.
La micropropagación, consiste en producir plantas a partir de porciones muy pequeñas de ellas, de tejidos o células cultivadas asépticamente en un tubo de ensayo o en otro recipiente, donde se puedan controlar estrictamente las condiciones del ambiente y la nutrición. Estos sistemas de propagación requieren de instalaciones como laboratorios y personal especializado para la realización de las labores. Esta técnica se ha convertido en una alternativa importante dentro de los métodos convencionales de propagación en una amplia gama de especies vegetales (Boutherin et al., 1994).
Abstract
Since ancient times, mankind has been engaged to play those plant species for their production and innate resistance to pests and disease characteristics they have been economically profitable; but these methods have been used only enabled them to plant over time in most cases was losing crossed hybrid vigor. Today with the new techniques of propagation of plant species such as the micropropagation has guaranteed himself healthy and pure plants able to increase production and to have the expected resistance to pests and diseases that afflict those plants.
The propagation of plants is to perform multiplication by both sexual and asexual means. Asexual reproduction, involves the propagation using vegetative parts of the original plant, is possible because each plant cell contains the genetic information necessary to generate a new plant, this feature is known as cell totipotency (Hartmann et al., 1995) .
Micropropagation is to produce plants from very small portions of them, tissues or cells grown aseptically in a test tube or other container, which can be strictly controlled environmental conditions and nutrition. These propagation systems require specialized laboratory facilities and to perform the work staff. This technique has become an important alternative within conventional methods of propagation in a wide range of plant species (Boutherin et al., 1994).
1. Introducción.
El concepto de cultivo vegetales de tejidos abarca el cultivo aséptico de tejidos como el de células y órganos, dentro de un grupo de técnicas que se fundamentan en varios principios como lo son el de la totipotencialidad celular propuesta por Heberlandt (1902) y la hipótesis del balance hormonal sugerida por Skoog et al. (1957). Las técnicas de cultivos asépticos han ayudado a un mejor entendimiento de los eventos que se dan en diferenciación celular y a un aprovechamiento eficiente de la explotación de las plantas como lo es el mejoramiento genético, obtención de plantas libres de virus y otros patógenos, conservación de germoplasma y micropropagación. Hasta el día de hoy, la micropropagación es la técnica que ha transcendido y perdurado con gran éxito desde la fase experimental a la aplicación práctica (Roca, W. 1993).
Según lo descrito anteriormente, se puede decir que cuando una célula con potencialidad de diferenciación se incuba en condiciones favorables, se regenerará un nuevo individuo, pero esto se obtiene si se cumplen algunas condiciones, como lo es el balance hormonal y otros factores que juegan un papel importante en la diferenciación (Roca, W. 1993).
La micropropagación se practica en especies hortícolas, ornamentales y en especies leñosas y esta técnica ha mostrado importantes ventajas si la comparamos con sistemas convencionales de propagación, algunas son: incremento de plantas derivadas por genotipo, reducción del tiempo de la multiplicación, multiplicación de grandes cantidades de plantas en espacios reducidos y a un menor costo, mayor y mejor control de la sanidad del material que se propaga, facilidad de transportar material de un lado a otro, etc (Roca, W. 1993).
2. Justificación.
La micropropagación es una de las técnicas de cultivo útiles cuando se trata de obtener ejemplares libres de enfermedades, más resistentes a los cambios de clima y con mayores posibilidades de reproducción a mayor escala. Dentro de esta técnica es posible lograr la conservación o recuperación de especies nativas y en vía de extinción.
La técnica de tejidos cultivados permite mejorar la cantidad y calidad del producto, se mejora la practica agrícola ya que se pueden realizar cultivos a todo lo largo del año y se homogenizan el tamaño de los ejemplares; se ofrece un mayor rendimiento posibilitando mejorar la oferta, con cantidades de plantas suficientes para ser cultivadas que satisfagan la demanda y comercialización.
Como técnica de cultivo, despierta el interés para llevar a cabo la experimentación con variedad de especies e invita a profundizar en el conocimiento tanto de la técnica como de sus ventajas o desventajas en la implementación y posterior desarrollo de cultivos a nivel de laboratorio.
3. Marco teórico.
3.1 Concepto.
La micropropagación es una técnica que se fundamenta en la teoría de la totipotencia la cual afirma que las células vegetales son autónomas y estas tienen la facultad regenerarse en una planta entera ya que posee la información genética necesaria para hacerlo. Esta técnica tiene potencial comercial ya que se obtienen plantas de forma masiva, rápida, de calidad y libre de patógenos (Perugorría, 2012)
La micropropagación consiste en producir plantas a partir de porciones muy pequeñas de ellas, de tejidos o células cultivadas asépticamente en un tubo de ensayo o en otro recipiente, donde se puedan controlar estrictamente las condiciones del ambiente y la nutrición (Hartmann y Kester, 1995).
El fin de la micropropagación es multiplicar o propagar plantas nuevas en grandes cantidades, plantas idénticas a la madre, tales como aquellas creadas por ingeniería genética, mutagénesis o mejoramiento genético.
3.2 Ventajas.
Según Margara (1988), permite propagar un gran número de especies difíciles de multiplicar, a menudo por los métodos clásicos puede realizarse con un nivel de proliferación elevado en un estado precoz de desarrollo, con frecuencia esta propagación in vitro se une a la lucha fitosanitaria, ya que las plantas obtenidas, son usualmente libres de virus, bacterias, hongos parásitos, y constituyen un material de calidad.
Por su parte Boutherin y Bron (1994), señalan otras ventajas como mejorar la selección, ya que a partir de un individuo notable, se puede comercializar rápidamente un clon interesante, garantía de homogeneidad, además limita o suprime los pies madre y por consiguiente libera superficies de invernadero y permite la programación de cultivos a lo largo de todo el año, o la producción en períodos muy precisos.
3.3 Desventajas.
Margara (1988) indica que se puede obtener “variantes” distintas a la planta madre por su morfología o fisiología, la necesidad de usar determinados tejidos para una especie dada, ya que se debe acudir a los tejidos aptos para sintetizarlos en forma natural. Boutherin y Bron (1994), mencionan el costo como desventaja ya que en una planta in vitro es más elevado que el de aquella multiplicada por métodos tradicionales. Sin embargo, este inconveniente se compensa con frecuencia con una ganancia de productividad, el riesgo de mutación porque la tasa de variabilidad es más elevada, por último, las dificultades de éxito, cierto número de vegetales se multiplican fácilmente in vitro, otros permanecen rebeldes a esta técnica, en especial en las especies leñosas.
3.4 Pasos en la Micropropagación.
3.4.1 Etapa 0: Preparación del material vegetal.
El empleo de explantes que se encuentran expuestos a bajos niveles de patógenos puede resolver el problema de la contaminación por hongos y bacterias durante el establecimiento del cultivo in vitro. Los factores que influyen sobre la calidad del explante son:
- El tipo de órgano que sirve como explante.
- La edad ontogénica y fisiológica del mismo
- La estación en la cual se colecta el material vegetal
- El tamaño
- El estado sanitario general de la planta donante.
La planta donante debe elegirse sobre la base de una selección masal positiva para las características agronómicas deseables. Una vez seleccionados los individuos, es preciso definir el tipo de explante a establecer en condiciones in vitro.
En general, los órganos jóvenes o bien rejuvenecidos son los que tienen mejor respuesta en el establecimiento que los obtenidos a partir de materiales adultos. Se recomienda colectar explantes primarios en campo cuando existe una brotación activa de las yemas, ya que el empleo de yemas en estado de dormición ocasiona serios problemas de contaminación.
A fin de lograr explantes de óptima calidad es conveniente hacer crecer las plantas donantes por un tiempo mínimo en condiciones de in vitro. De esta forma es posible incidir directamente sobre el estado sanitario y la calidad de los explantes mediante el control de la intensidad lumínica, temperatura y reguladores de crecimiento. Para especies ornamentales tropicales y subtropicales se recomienda mantener las plantas donantes en condiciones de alta temperatura (25ºC) y baja humedad relativa (75%), a fin de reducir la proliferación de patógenos.
Los procesos morfogénicos de floración, dormición y bulbificación son controlados por el fotoperíodo y la temperatura. Controlando estos factores también es posible obtener plantas donantes y explantes más homogéneos durante todo el año. Pueden aplicarse además pretratamientos con reguladores de crecimiento a las plantas donantes, así como también a los explantes mismos.
En especies leñosas suele utilizarse como pretratamiento la inmersión de los explantes primarios en soluciones con citocininas a fin de inducir la brotación de yemas.
3.4.2 Etapa 1: Establecimiento del cultivo
El objetivo de esta etapa es establecer cultivos viables y asépticos. El éxito está determinado por la edad de la planta donante, la edad fisiológica, el estado de desarrollo y el tamaño del explante. En esta etapa los principales procesos a controlar son la selección, el aislamiento y la esterilización de los explantes.
Los materiales que demuestran tener mayor capacidad regenerativa son los obtenidos de tejidos meristemáticos jóvenes, sean yemas axilares o adventicias, embriones o semillas en plantas herbáceas y aquellos tejidos meristemáticos que determinan el crecimiento en grosor, como el cambium en las plantas leñosas. En este sentido, es importante señalar que el empleo de yemas adventicias está asociado con una mayor probabilidad de ocurrencia de variantes somaclonales respecto de los sistemas de propagación, basados en la regeneración a partir de yemas axilares o embriones somáticos. (Figura 1).
La obtención de cultivos asépticos puede lograrse trabajando sobre aspectos preventivos como curativos. Una acción preventiva la constituye el empleo de métodos de verificación de patógenos en los explantes. Esto puede realizarse mediante análisis específicos para las enfermedades del cultivo, tales como DAS-ELISA o PCR, análisis generales para patógenos cultivables como el empleo de medios de cultivo para el crecimiento de bacterias y hongos y métodos específicos para la detección e identificación de patógenos intracelulares como virus, viroides y bacterias.
La realización de estos análisis directamente sobre las plantas donantes, previo establecimiento, presenta dos ventajas. En primer lugar, el empleo de tejidos maduros permite visualizar los síntomas más marcados de la enfermedad; en segundo lugar, la carga de patógenos es mayor y por lo tanto la precisión del sistema de detección aumenta. Por otro lado, las plantas enfermas pueden tratarse con técnicas adecuadas para la eliminación de patógenos como la termoterapia, la quimioterapia a través de la aplicación de antibióticos, desinfectantes, antivirales y el cultivo de meristemos.
La desinfección superficial incluye varios pasos: el lavado de los explantes con agua corriente, el empleo de etanol al 70% por 1 minuto, seguido de concentraciones variables de hipoclorito de sodio (0,5 a 1,5% de cloro activo) con unas gotas de tensoactivos para favorecer su penetración y actividad. Posteriormente, los explantes deben ser enjuagados al menos tres veces con agua destilada estéril.
Algunos patógenos permanecen latentes y se expresan cuando son transferidos a un medio de cultivo nuevo. En general, estos patógenos incluyen los patógenos superficiales del material vegetal, los patógenos endógenos y los patógenos propios del manejo en laboratorio. En la Etapa 1, también pueden observarse infecciones por bacterias y hongos asociados a trips que sobreviven a los tratamientos de esterilización y por patógenos endógenos latentes dentro del sistema vascular, resultado de una esterilización inefectiva de los explantes. Estos patógenos latentes podrían manejarse mediante el empleo de bacteriostáticos o antibióticos en el medio de cultivo.
Durante esta fase se espera que los explantes que sobrevivieron la FASE 1 originen brotes (de procedencia axilar o adventicia) con varias hojas. En la base de cada hoja hay una yema que se desarrollará luego de ser puesta en contacto con el medio de cultivo. Periódicamente estos nuevos brotes se deben subcultivar en un nuevo medio mediante divisiones y resiembras en tubos de cultivo u otros recipientes adecuados. Estas operaciones se realizan en la cámara de flujo laminar o en un lugar aislado que nos permita mantener las condiciones de asepsia. De esta forma aumenta el número de plantas en cada repique o división de las plantas.
El número de plantas que se obtiene dependerá de la especie vegetal y de las condiciones del medio de cultivo. El número de plantas que se obtiene por la vía de la micropropagación permite alcanzar incrementos exponenciales, considerando que todos los factores que afectan el crecimiento hayan sido optimizados.
El objetivo de esta etapa es mantener y aumentar la cantidad de brotes para los nuevos ciclos de multiplicación sucesivos y poder destinar parte de ellos a la siguiente etapa de producción (enraizamiento, bulbificación, etc.). Es importante señalar que en esta etapa, cualquiera que sea la vía de regeneración empleada, es conveniente evitar la formación de callo para disminuir el riesgo de variación somaclonal. En esta etapa, los medios de cultivo, los reguladores de crecimiento como auxinas, citocininas y ácido giberélico y las condiciones de crecimiento juegan un papel crítico sobre la multiplicación clonal de los explantes.
Figura 1. Vias morfogeneticas.
Fuente: Micropropagación y proyectos de producción. Facultad de Agronomía - Universidad de la República, Uruguay, 2008
La principal desventaja del primer método es que el número de yemas axilares por explante limita la cantidad de vástagos. Esto se ve compensado, sin embargo, por un aumento en la tasa de multiplicación con los sucesivos subcultivos. La formación de yemas adventicias ofrece mayor potencial para la producción de vástagos, ya que la inducción de vástagos ocurre en sitios distintos al de los meristemos.
La embriogénesis somática es una vía más conveniente porque permite saltar las etapas de formación de yemas y enraizamiento regenerando plantas en una forma mucho más rápida y eficiente, disminuyendo además el riesgo de variación somaclonal. A su vez, la disponibilidad de protocolos para la obtención de embriones somáticos es clave para la automatización de la micropropagación y la consecuente reducción de costos para su implementación a escala comercial. (Figura 1).
La etapa de multiplicación generalmente comprende dos períodos, la fase de inducción y la fase de multiplicación propiamente dicha. La primera implica, generalmente, el empleo de concentraciones elevadas de reguladores de crecimiento (generalmente de auxinas más que citocininas) para favorecer la desdiferenciación. La segunda etapa requiere del empleo de un balance hormonal adecuado para favorecer los procesos de diferenciación y multiplicación celular. En este caso, el sistema es más dependiente de reguladores del tipo de las citocininas. En algunos casos, como ocurre en la formación de embriones somáticos, se requiere de una tercera y cuarta etapa, denominadas de maduración y de germinación respectivamente, cuya duración varía entre 1 a 2 semanas.
3.4.4 Etapa 3: Enraizamiento y aclimatación.
En esta etapa se produce la formación de raíces adventicias. En las especies herbáceas es relativamente fácil mientras que en las especies leñosas es complicado por su limitada capacidad rizogénica. El enraizamiento puede realizarse tanto en condiciones in vitro como ex vitro. La siguiente lista presenta una comparación de las características de una planta en condiciones de laboratorio (in vitro) respecto a una planta en condiciones naturales (in vivo):
In vitro
- No realiza fotosíntesis
- Crecimiento en condiciones controladas
- Crecimiento en condiciones de asepsia
- Alta humedad relativa
- Estomas no funcionales
- Ausencia de pelos radiculares
- Ausencia de cera en la cutícula.
In vivo
- Realiza fotosíntesis
- Crecimiento en condiciones no controladas
- Exposición a los patógenos y gérmenes del ambiente
- Humedad relativa variable
- Estomas funcionales
- Presencia de pelos radiculares
- Presencia de cera en la cutícula
Los sustratos incluyen: medio solidificado con agar, perlita y/o vermiculita humedecidas con medio nutritivo o agua. En un medio solidificado con agar, los nutrientes se reducen de 1/2 a 1/4 de la composición original, y la sacarosa se reduce a una concentración final de 1-2%. Medios con baja concentración salina, como el WPM (Lloyd & Mccown, 1980) y GD (Gresshoff & Doy, 1972), incrementan el porcentaje de enraizamiento de vástagos axilares en plantas.
El empleo de agar presenta ventajas y desventajas sobre la rizogénesis. Por un lado, el enraizamiento de especies forestales en agar se favorecería al producirse una rizogénesis más sincrónica como resultado del contacto íntimo de las estacas con el medio de cultivo. Sin embargo, las raíces producidas por este método son usualmente delgadas y no se forman raíces cabellera. Adicionalmente, el empleo de agar está asociado con la formación de callo en la base de las estacas, que conduce al establecimiento de conexiones vasculares interrumpidas entre raíces y vástagos.
Comúnmente, a fin de proceder a su enraizamiento, los vástagos de buen tamaño proveniente de la etapa de multiplicación y provisto de al menos 4-5 yemas, se colocan durante períodos cortos en soluciones con concentraciones elevadas de auxinas.
La auxina más utilizada es el IBA (ácido 3- indolbutírico), que puede utilizarse a concentraciones de 1-10 mM durante pocas horas. Alternativamente se pueden emplear niveles más bajos de auxinas (0.1 a 1mM), pero manteniendo la inducción por un período más prolongado (3 a 7 días). Luego los vástagos se transfieren a un medio de cultivo basal desprovisto de reguladores de crecimiento para permitir el desarrollo de las raíces.
Aproximadamente 20 días después del tratamiento de inducción es posible la obtención de una adecuada cantidad de raíces funcionales que permitan continuar hacia la etapa de aclimatación.
Es importante acentuar que el uso de auxinas a elevadas concentraciones es contraproducente porque induce la formación de callo en la base de las estacas. Por ello, para cada cultivo es necesario optimizar un protocolo de rizogénesis que minimice la formación de callo y maximice la tasa de rizogénesis y supervivencia de las plantas.
El enraizamiento ex vitro permite que el enraizamiento y aclimatación se logren simultáneamente y que raramente se forme callo en la base de las estacas, asegurando así una conexión vascular continua entre el vástago y la raíz. Sin embargo, el estrés asociado a la evapotranspiración acelerada de las plantas durante las etapas iniciales del trasplante puede reducir considerablemente la tasa de supervivencia. Por ello, es conveniente contar con instalaciones de invernadero o cámaras de crecimiento adecuadas para brindar temperatura y humedad relativa moderadas, que permitan lograr la rusticación de las plantas en forma progresiva. Bajo condiciones ex vitro se utilizan diferentes sustratos, mezclas de tierra y arena y/o abonos, los cuales conviene que estén debidamente esterilizados.
Figura 2. Procesos de micropropagación.
Fuente: http://ocw.udl.cat/enginyeria-i-arquitectura/fructicultura/continguts-1/l-7/monografia-no-7-cap.-6.-microprop.-y-otros-metodos
3.5 Factores que influyen en la Micropropagación.
Los factores que influyen drásticamente en la micropropagación son: el explante, la planta donadora, la composición de los medios de cultivo y los factores físicos (luz y temperatura), a continuación se detallan éstos factores.
3.5.1 El explante.
El explante es una parte del tejido o de un órgano que se aísla del resto de la planta para ser cultivado en condiciones in vitro, sobre un medio de cultivo. Los explantes pueden provenir de raíces, hojas, meristemos vegetativos o reproductivos, semillas, tallos, ápices, yemas axilares, tejido ovular, anteras, granos de polen, etc. (Roca y Chavez, 1991).
Figura 3. Explante.
Fuente: http://dorantsblossom.blogspot.com/2012/03/233-explantes.html
El explante y su procedencia son importantes tanto para su disponibilidad como para su manipulación. Es necesario utilizar material establecido en invernadero y viveros que permitan reducir la incidencia de microorganismos patógenos y así obtener una respuesta rápida del explante, los materiales a cultivar deben proceder de plantas jóvenes .(Roca y Chavez, 1991)
En la mayoría de los casos, la micropropagación se lleva a cabo utilizando yemas o meristemos caulinares como material de partida. Los meristemos tienen la ventaja de ser un material muy estable desde un punto de vista genético y de encontrarse normalmente libre de virus. No obstante, a menudo resulta difícil su utilización debido a que su manipulación es más compleja a consecuencia de su reducido tamaño (0,2 - 1,0 mm) y al largo período de tiempo requerido para el desarrollo de los tallos. Debido a ello es más frecuente la utilización de explantes caulinares constituidos por el meristemo apical y uno o más nudos, debido a que son más fáciles de manipular, se establecen rápidamente y a menudo proliferan bien (Roca y Chavez, 1991).
La asociación explante-medio y las condiciones físicas en que normalmente se incuban los cultivos conforman un ambiente propicio para la proliferación de microorganismos (bacterias, hongos), los cuales pueden destruir tales cultivos, competir con el explante por el medio de cultivo o modificarlo. Evitar las contaminaciones con microrganismos es un aspecto básico que se debe tener en cuenta para el éxito. Para establecer cultivos asépticos es necesario: a) trabajar en ambientes adecuados; b) esterilizar los medios de cultivo; c) desinfectar superficialmente los explantes, para liberarlos de microorganísmos exógenos y d) Manejar adecuadamente las normas de asepsia.
Figura 4. Área de trabajo.
Fuente: https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEiGZTb5nO8zRZwXWBe87DF70hhSyHUOkEy4CdZzLX9-IVz_gzGZ4azvis2rMN3ewDWA6iVHs9hANe0JVxDth0eCg8EtH0F96lya61BgXpH3DDJ-hdFbSxulklALYy3tUjCWDeDxtA1hiJ6q/s1600/C.png
Es generalizado el uso de etanol (70 % v/v) y de hipoclorito de sodio (NaOCl) del 1 al 3 %. Con menor frecuencia se usan el hipoclorito de calcio [Ca (OCl)]2, del 6 al 12 % y el cloruro de mercurio (HgCl2) del 0.1 al 1.5 %. En algunos casos es útil agregar algún agente tensoactivo (por ejemplo, Tween-20, del 0.01 al 0.1 %). No es necesario cuando se incluye un primer lavado con etanol. Posteriormente es necesario dar varios lavados con agua destilada estéril dentro de la cámara de flujo laminar. Por último vale tomar en cuenta que la desinfección debe eliminar los microorganísmos con el menor daño al explante.
Según PEREZ PONCE (1998) un medio de cultivo puede ser definido como una formulación de sales inorgánicas y compuestos orgánicos requeridos para la nutrición y manipulación de los cultivos. Existen numerosas formulaciones, cada una de las cuales comprende entre 6 y 40 compuestos. Básicamente, los medios de cultivo se componen de:
- Fuente de carbono: Prácticamente todos los cultivos son heterótrofos (comparativamente unos pocos son autótrofos) y por ende necesitan del suministro de una fuente de carbono. La sacarosa, en concentraciones de 2 al 5%, es el azúcar más utilizado.
- Nutrientes minerales: Los medios de cultivo deben suministrar los macro y micronutrientes esenciales para el crecimiento de las plantas enteras. En general, se destacan las concentraciones relativamente altas de nitrógeno y potasio.
- Sustancias vitamínicas: De todas las que comúnmente se incorporan a los medios, pareciera que la tiamina es la única realmente imprescindible para el buen crecimiento de los cultivos.
- Sustancias reguladoras del crecimiento: En la mayoría de los casos los medios utilizados para el establecimiento de los cultivos contienen auxinas (ANA, 2,4-D, AIA, IBA, NOA, Dicamba, Picloram) y/o citocininas (BA, CIN, ZEA, 2iP, Thidiazurón). Las giberelinas (especialmente GA3) son requeridas en algunas ocasiones para el cultivo de meristemas o para la elongación de brotes.
- Agente gelificante (en el caso de medios semisólidos): El agar (entre 0,6 y 1%) es el compuesto más utilizado. También pueden emplearse: Agargel (0,40-0,60%), Transfergel (2-2,60%), Phytagel (0,25- 0,40%), agarosa (0,80-0.90%) y Gelrite (0,10-0,20%).
- Otros compuestos: Muchas sustancias, de variada composición química, suelen ser adicionadas a los medios básicos. Además de la glicina, otros aminoácidos se pueden agregar a los medios. (Pérez, 1998)
Fuente: http://biotecnologiavegetalzaos.blogspot.com/2009/05/produccion-invitro-de-flores.html
3.5.4 Condiciones ambientales.
La incubación de los cultivos se debe llevar a cabo en condiciones controladas. Por lo menos en lo que se refiere a temperatura, calidad e intensidad de luz, fotoperíodo, humedad atmosférica e higiene. Estas condiciones se logran con el empleo de cámaras climatizadas o cuartos especialmente preparados con aire acondicionado (frío-calor), una buena y uniforme circulación de aire en el interior, dotados de un buen sistema de alarma para interrumpir la iluminación en caso de no funcionar el aire acondicionado. En general, los cultivos son incubados a temperatura constante de 25-28 ºC, con ciclo de luz/oscuridad de 16/8horas. La luz es generalmente provista por lámparas fluorescentes del tipo «luz día» con una irradiación de entre 50 y 200μmol.m-2.s-1. La humedad atmosférica debe ser elevada (80-90%). (Pérez, 1998).
Figura 6. Cuarto de crecimiento in vitro.
Fuente: http://www.cultigar.es/como_lo_hacemos.php
3.6 Micropropagación de Especies Herbáceas.
La micropropagación de especies herbáceas está orientada a proveer material libre de patógenos, propagar material seleccionado por su mayor rendimiento o por su mayor resistencia a enfermedades y estreses ambientales, conservar la diversidad específica en bancos de germoplasma, obtener material para estudios fisiológicos y genéticos y sentar las bases para la aplicación de técnicas de ingeniería genética (Olmos et.al, s.f).
Existen protocolos para las especies, en todos los casos, las formas de propagación son las mismas. Se emplean vías de regeneración por formación de yemas axilares, yemas adventicias y embriogénesis somática. En los dos primeros casos, el sistema de propagación a través de la organogénesis directa asegura la estabilidad genética de las plantas regeneradas y se emplean cuando el objetivo es la propagación clonal a gran escala. La embriogénesis u organogénesis indirecta, con formación de callo, se emplea en cambio para generar variabilidad en programas de mejoramiento (Olmos et al, s.f). (Figura 1).
La aplicación de técnicas biotecnológicas hace que la producción de especies leñosas se realice de forma masiva lo cual hace que se obtenga clones con alto porcentaje de rendimiento, volumen y uniformidad al momento del cultivo y de la cosecha (Suárez et al., 2006).
La propagación vegetativa se ha utilizado para incrementar la productividad y obtener materiales libres de agentes patógenos y puede lograrse por medio de cultivo de tejidos; dentro de esta técnica la micropropagación ha sido la más difundida y utilizada la cual se ha convertido en parte de programas para el mejoramiento genético de especies (Martínez et al., 2005).
De las especies leñosas más estudiadas en los últimos años han sido las especies forestales y dentro de estas, las coníferas. La primera especie regenerada a partir de callos mediante cultivo de tejidos fue Populus tremuloides y la primera gimnosperma a partir de embriones fue Pinus palustris (Villamizar, 2005).
Se ha probado que es mejor obtener los brotes adventicios de explantes y no de callos, pues su formación es complicada y generalmente se producen anormalidades. También se ha observado que en in vitro, la edad del explante es un elemento limitante en las especies forestales y la micropropagación se torna fácil cuando se utiliza tejidos juveniles (Villamizar, 2005).
Varios problemas se presentan en la micropropagación de especies leñosas algunos de esos inconvenientes son: variación genética al momento de la regeneración y maduración in vitro (esto hace que se dificulte la obtención de fenotipos seleccionados), malformación de órganos y plantas, dificultad para erradicar infecciones internas y secreción de sustancias toxicas y volátiles (Villamizar, 2005).
Debido a lo sofisticado de la técnica, la micropropagación es restringida y aplicada solo en laboratorios de investigación o en grandes empresas que cuentan con recursos para el mantenimiento del proceso y hacerlo costeable económicamente, lo cual es un hecho debido a la gran cantidad de plantas que por esta vía se obtienen.
Es justificable el método solo en plantas con reproducción natural difícil, plantas en peligro de extinción, plantas con características importantes únicas como las transgénicas y plantas de uso ornamental con valor unitario elevado.
Estas técnicas de propagación in vitro han abierto nuevas posibilidades para el manejo de la genética básica y obtener nuevos cultivares.
Dentro de las alternativas se presentan la facilidad de la creación y mantenimiento de nuevo material genético para la clonación in vitro, la obtención de material haploide a partir de anteras o cultivo de óvulos e incrementar la variabilidad genética por métodos de hibridación, selección y obtención de mutantes.
A nivel práctico se han obtenido cultivares mejorados, producción de semillas de variedades comerciales y una rápida propagación (clonación) de cientos de especies.
5. Bibliografía.
Boutherin, D. y Bron, G. (1994). Multiplicación de plantas hortícolas. Zaragoza, Acribia. 225 p.
Hartmann, H. y Kester, E. (1995). Propagación de plantas. Principios y Prácticas. 4a. ed. México. D.F. Continental. 760 p.
Margara, J. (1988). Multiplicación Vegetativa y Cultivo in vitro. Madrid, Mundi- Prensa. 236 p.
Martines R, Azpiroz HS, Rodriguez JL, Cetina VM y Gutierrez MA (2005). Aclimatación de plantas obtenidas in vitro de Eucalyptus urophylla y Eucalyptus grandis. Universidad Autónoma Indígena de México. Ra Ximhai : 1: 3.
Olmos, S., Luciani, G. y Galdeano, E. (s.f). Parte IV: Métodos de propagación y conservación de germoplasma: Capitulo 1: Micropropagación. Biotecnología y mejoramiento vegetal. Recuperado de: http://www.argenbio.org/adc/uploads/Libro_INTA_II/Parte_IV.pdf
Pérez, J.N. 1998. Propagación y Mejora Genética de Plantas por Biotecnología. Instituto de Biología de Plantas. Santa Clara. Cuba. 390 pág.
Perugorría Larroque, M. (2012). Desarrollo de una técnica para micropropagación de especies leñosas en biorreactores. Universidad de la Republica. Uruguay.
Roca, W. y Mroginski, L. Cultivo de tejidos en la agricultura, fundamentos y aplicaciones. Colombia: CIAT, 1993.
Suárez IE, Jarma AJ y Avila M (2006). Desarrollo de un protocolo para la propagación in vitro de Roble (Tabebuia rosea Bertol DC). Universidad de Córdoba, Departamento de Ingeniería Agronómica y Desarrollo Rural. Temas agrarios: 11: 2.
Villamizar EA. (2005). Estandarización del protocolo in vitro para el establecimiento de Encenillo (Weinmannia tomentosa) y de Rodamonte (Escallonia myrtilloides) en el laboratorio de cultivo de tejidos del jardín botánico José Celestino Mutis. Universidad Francisco de Paula Santander.
